martes, 16 de junio de 2009

"Proceso de Siembras en Cultivos y Aglutinacion"









PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA





INTRODUCCIÓN

Enseguida se muestran todas las practicas que realizamos en la unidad 3 , análisis clínico del grupo 2LM, todas las practicas estuvieron muy interesantes pero también algo difíciles de realizar pero no imposible claro esta ,cada practica tiene sus propias cualidades y todas son diferentes en el modo de realizarlas, en seguida se muestra el orden de las practicas que realizamos :

1. Medio de cultivo.
2. Técnicas de esterilización.
3. Siembras de caja en forma de estrías.
4. Observación macroscópica.
5. Frotis.
6. Tinción de gran.
7. Observación microscópica.
8. Aglutinación en suero.
9. Aglutinación en sangre.

Cada una de las prácticas se realizo en el laboratorio de química de forma grupal y por mesa, en estas prácticas aplicamos todo lo aprendido con anterioridad y estudiado. Todas las prácticas fueron muy interesantes por que aprendes cosas que jamás habías hecho o mirado, esperemos y este trabajo sea de su total agrado.




MEDIOS DE CULTIVO

Iniciamos la práctica de medio de cultivo prendiendo el auto clave colocándole el agua que ocupa y preparándolo para luego esterilizar el medio de cultivo.

Mientras se preparaba el auto clave re hidratamos el Agar de acuerdo a las indicaciones que la etiqueta marcaba, utilizando la regla de tres de acuerdo a cuantas cajas petri utilizaremos y dependiendo el Agar que utilizamos y el agua que se ocupa.

Realizamos una operación con la cual sacamos que para hacer 8 cajas petri (una para cada integrante del equipo) ocuparemos 160 ml. De agua 1 gr. Por caja petri o sea 8 gr. De Agar.
Y así empezamos esterilizando el material que ocuparemos para no contaminar el medio de cultivo. Ya esterilizado el material juntamos el Agar con el agua ya medida en el matraz de Erlenmeyer y la disolvimos con la varilla de cristal ya esterilizada hasta que no queden grumos, dejamos reposar ya que la etiqueta lo dice.

Ya reposado el medio de cultivo nos pusimos un guante el cual no pasa el calor a la mano y no nos quememos, colocamos el medio de cultivo arriba de la llama del mechero de bunsen agitando solo la muñeca por un minuto metiéndolo al mechero y luego retirándolo y así sucesivamente hasta que este llegue a su punto de ebullición y cuidando que no se vaya a tirar.
Lo colocamos en la mesa de trabajo para que se enfrié, ya frió lo tapamos con torundas de algodón y aseguramos con masquen tape después le pusimos el numero de mesa, la hora, y la fecha.
Para eso el auto clave ya estaba preparado y metimos los matraces en los dos auto claves en uno metieron las primeras tres mesas y en el segundo las otras tres mesas cerramos el auto clave asegurando que no se encuentre peligro ya que haya transcurrido el tiempo de esterilización sacamos el vapor poco a poco de acuerdo a la técnica de esterilización hasta que ya este listo y lo sacamos del auto clave con mucho cuidado.

El profesor no dio unas cajas petri de plástico donde colocaremos el medio de cultivo las 8 cajas petri la colocamos en el campo de esterilización junto con el matraz que contiene el medio de cultivo y así fuimos midiendo el Agar con el vaso precipitado de 25 ml. Para pasarlo a cada caja petri lo que cada una debe contener tratando de no contaminar.
Cuando pasamos el medio de cultivo a la caja petri lo dejamos un poco abierto para que salga el vapor ya habiendo terminado este proceso apilamos las cajas petri con el medio de cultivo contenido dentro y lo aseguramos con masquen tape y etiquetamos con el nombre, la fecha, la mesa, y la hora.

Se le entrego al encargado de laboratorio para que este lo llevara a incubación.




medio de cultivo solido en cajas petri

ESTERILIZACION

La esterilización se lleva acabo por el auto clave del laboratorio es un dispositivo que sirve para esterilizar material de laboratorio, utilizando vapor de agua a alta presión y temperatura para ello, evitando con las altas presiones que el agua llegue a ebullir a pesar de su alta temperatura. El fundamento de la autoclave es que coagula las proteínas de los microorganismos debidos
A la presión y temperatura, aunque recientemente se ha llegado a saber de algunos microorganismos, así como los priones, que pueden soportar las temperaturas de autoclave. Las autoclaves funcionan permitiendo la entrada o generación de vapor de agua pero restringiendo su salida, hasta obtener una presión interna de 103 kPa, lo cual provoca que el vapor alcance una temperatura de 121 grados centígrados. Un tiempo típico de esterilización a esta temperatura y presión es de 15-20 minutos. Las autoclaves más modernas permiten realizar procesos a mayores temperaturas y presiones, con ciclos estándares a 134 ºC a 200
kPa durante 5 min para esterilizar material metálico; llegando incluso a realizar ciclos de vacío para acelerar el secado del material esterilizado. El hecho de contener fluido a alta presión implica que las autoclaves deben ser de manufactura sólida, usualmente en metal, y que se procure
Construirlas totalmente herméticas. También se utilizo en la primera práctica que tuvimos en el laboratorio fue en la practica de medio de cultivo, cuando ya se tenia caliente el medio de cultivo depuse de que hirvió se tapo y se introdujo en la auto clave a 15gr de presión en 15 min. Ya pasado los 15 min. Se paso a pasear el medio de cultivo alas
Cajas peri, pero también tuvimos nuestra área de esterilización en la practica de de raspado como teníamos que tener las cajas petri destapadas teníamos que tenerlas en medio de la mesa con dos mecheros encendidos con las cajas petri en medio de la mesa pero en nuestra are de esterilización por los dos mecheros encendidos y a si se ase una área un poco caliente y no se pueden contaminar y también seguimos usando esta técnica asta la practica Frotis con agua destilada.


autoclave

TOMA DE MUESTRAS

(Saliva, interdentales, raspado de pie, orina, agua fresca, muestra de sangre)


Para la toma de muestra se ocupa estar con su equipo de bioseguridad,
Y puntualmente.

Ocuparemos un Hisopo para realizar la toma de muestra de saliva,
Se saca muestra de saliva debajo de la lengua en las encías en las paredes dentales y para poder así obtener la saliva que se requiere para la muestra.

Interdentales:
Igual se ocupa un Isótopo para poder realizar esta muestra por que se tomara entre los dientes para poder así obtener los gérmenes que se requieren para esta muestra se deposita en una laminilla para poder observarla microscópicamente o como lo requiera la practica.

Interdigital en pies:
Se obtiene entre los dedos de los pies con una laminilla raspándole
Fijamente entre los pies hasta obtener el raspado que se requiere y así poder realizar lo que se requiere, ya obtenida el raspado requerido se deposita en una laminilla para poder observarla microscópicamente o como lo requiera la practica.

Orina:
Se Obtiene la Muestra de orina en ayunas o sin ella
Por que esta muestra no requiere de ella así que el paciente puede ir en ayunas o no si lo desea se deposita en un vaso precipitado bien esterilizado ya que así no obtenga otro germen que no se de ello.

Agua Fresca:
Se obtiene del agua como por ejemplo de la llave cuando lavan las verduras y frutas y depositarlas igualmente en un vaso precipitado ya esterilizado y después se prosigue con lo que la practica nos indica la correspondiente.

toma de muestra sanguinea

SIEMBRAS EN FORMA DE ESTRÍAS.

Ya después de haber echo los medios de cultivo, solidificados y esterilizados, se pasa a la siembra en forma de estrías. Para esto se hace antes la tomas de muestras. Estas muestras pueden ser de orina, saliva, interdigital en pies, agua fresca, sangre [fresca], agua de vegetal, interdental y de frijol.
Ya teniendo las muestras listas se pasa a la siembra en forma de estrías para lo cual necesitaremos los siguientes materiales:
· Asa bacteriológica o de platino
· Vaso de precipitados con agua destilada[25 ml]
· Mecheros de bunsen
· Cajas petri con medio de cultivo ya elaborado
· Papeles para cubrir mesa
· Masquen tape para etiquetar las siembras
La siembra se va a realizar sobre un medio de cultivo solido, comenzando por hacer el campo de esterilización el cual consiste en poner 2 mecheros bunsen encendidos, teniendo estos en medio los materiales necesarios sobre el papel para cubrir la mesa, todos los materiales se deben esterilizar antes de ser usados en la practica, esto consta de ponerlos en el fuego que despide el mechero y dejarlos ahí por un minuto, ya esterilizados se les dará uso.
Se toma el asa bacteriológica y se esteriliza, y se toma una pequeña porción de la muestra que se valla a sembrar, se siembra de forma estriada, esta forma puede variar dependiendo de el tipo de siembra que se valla realizar.
Las siembras que se pueden realizar son las siguientes:
· Por agotamiento:
Que esta cubre alrededor de la caja de petri, y en el centro una línea que va de arriba hacia debajo de forma que va de gruesa a mas delgada tiene apariencia de remolino.
· Por dispersión:
Esta va de líneas que desenlosen desde el centro hasta las orillas en las direcciones hacia afuera.

· kass:
Este es forma de “M”, con una pequeña línea cruzada al medio, horizontalmente.
· Cuadriculado:
Este es completamente en toda la caja petri, de forma cuadriculada en toda su extensión.
· Mac Conkey:
Esta se realiza solo sobre una esquina en contra esquina, una casi asta la mitad y la otra solo una pequeña parte de modo que las dos tengan un punto de unión.
· 4 Estrías:
Estas son solo cuatro estrías de forma vertical.
· Simple:
Este es muy parecido al de dispersión, solo que este va de afuera hacia adentro, en forma muy indefinida de rayos cada línea.
Una vez ya echa la siembra de la forma que haya sido indicada, se cierra la caja petri, dentro del campo de esterilización se etiqueta la caja con los datos (nombre, muestra, estría sembrada, fecha, hora,). Ya etiquetadas se pasan a la incubación.
Esta es realizada en una estufa de incubación en la cual se realizara de 37’C, durante 24, 48, 72 hrs.
Después de esto se pasa a la observación macroscópica de las siembras


medios de cultivo solidos agar en sangre agar mac conkey



OBSERVACION MACROSCOPICA

Al iniciar la práctica recibimos información para poder trabajar. En lo que sigue se toma papel blanco para mesa para cubrirla luego dos mecheros de bunsen para sí tener nuestro campo de esterilización, entonces encendimos los mecheros para así poder esterilizar las azas bacteriológicas y poder hacer el estriado en los medio de cultivo ya elaborados.
A continuación explicaremos como hicimos cada estriado:

1) El crecimiento de la siembra fue en forma de círculos con un color morado y tiene un olor putrefacto entre almendras con unos puntitos negros alrededor del crecimiento, mide 0.09cm x 0.1cm y esta estría simple fue hecha en Agar eosina y azul metileno.
2) creció con varias manchas color moradas, tienen forma irregular, olor fétido, mide 1.08cm x0.3cm y fue hecho en el Agar EMB y el extraído se llamo kass.
3) es la siembra de sangre por agotamiento en el Agar metileno, tiene un olor a pescado, no se observo crecimiento.
4) medio de cultivo fue el simple interdental en Agar MacConkey tiene color morado en forma de puntitos diminutos, olor a carne cruda midió 0.3cm.
5) medio de cultivo Agar EMB por el estriado de kass presenta un olor a mantequilla teniendo un color morado y obtuvo un poco de crecimiento.
6) medio de cultivo por dispersión en muestra de orina con un olor blanco en forma de puntos, olor a comida de gato, su medida fue de diminutos puntos, en Agar salmonella shingella.
7) medio de cultivo (cuadricular) color verde en forma de circulo, olor a pasto recién cortado mide 4.2cm en Agar dextrosa saborada.
8) medio de cultivo por agotamiento muestra interdental tiene color verde con amarillo un olor a leche podrida mide 1.5cm.

observacion macroscopica de medios de cultivos solidos sembrados


FROTIS

Para elaborar un Frotis tienes que tener la caja petri con el medio de cultivo ya elaborado, un asa bacteriológica, vaso de precipitado con 25ml. De agua destilada, dos mecheros de bunsen para hacer el campo de esterilización, un porta objetos.

Lo primero que se hace es esterilizar el asa bacteriológica sobre la flama del mechero, después el asa se introduce dentro del vaso de precipitado tomando una gota con la curvatura que tiene en la punta, esa gota es depositada en el porta objetos, posteriormente su vuelve a esterilizar el asa y se raspa un poco el medio de cultivo y los residuos se mezclan en el porta objetos con la gota de agua destilada con un movimiento de muñeca de izquierda a derecha haciendo que quede una capa ligera, posteriormente ya hecho este proceso el porta objetos es pasado por la flama del mechero para que se seque el agua.

Una vez hecho, el porta objetos es etiquetado con el numero de mesa y enumerados por orden alfabético. Posteriormente con este se elaborara la tinción de Gram




DESARROLLO
Agregar azul violeta (cristal violeta o violeta de genciana) y esperar 1 min. Este tinte (al final del procedimiento) dejará de color morado solo a las bacterias Gram positivas.
Enjuagar con agua.
Agregar lugol y esperar 30 segundos
Enjuagar con agua.
Agregar alcohol acetona y esperar 15 s
Enjuagar con agua.
Agregar safranina y esperar 1 min. Este tinte dejará de color rosado las bacterias Gram negativas.
Enjuagar con agua.
Para observar al microscopio óptico es conveniente hacerlo a 100x con aceite de inmersión

Tinción:
Con violeta cristal o violeta de genciana, utilizando una cantidad suficiente de dicho colorante sobre la muestra, como para lograr cubrirla por completo. Se deja actuar al colorante por 1 minuto. Esta tinción de 1 minuto está dada para trabajar a una temperatura ambiente de 25 ºC.
Enjuague:
Al transcurrir el minuto, se debe enjuagar la lámina conteniendo la muestra con agua corriente. Para realizar el lavado, se debe tener en cuenta que el chorro de agua NO debe caer directamente sobre la muestra, ésta debe caer sobre la parte superior de la lámina que no contiene muestra. El chorro debe ser un chorro delgado, aproximadamente de medio a un centímetro de espesor. También el enjuague se debe realizar poniendo la lámina en posición inclinada hacia abajo... Una vez enjuagado el portaobjetos, se aplica como mordiente yodo o lugol durante 1 minuto más.
Decoloración:
Pasado el minuto de haber actuado el mordiente, el Frotis se decolora con etanol al 75 %, etanol al 95 %, acetona o alcohol-acetona, hasta que ya no escurra más líquido azul. Para esto se utiliza el gotero del frasco del decolorante. Se van añadiendo cantidades suficientes del decolorante, hasta lograr que éste salga totalmente transparente, es decir, hasta que ya no escurra más líquido azul
Lavado y secado:
Lavar con agua para quitar los residuos de decolorante y esperar que seque la lámina al aire libre o con la ayuda de la llama de un mechero de la forma anteriormente descrita.



tecnica de tincion de gram de un frotis



bacterias gram positivas bacterias gram negativas


OBSERVACION MICROSCOPICA

Como en cada una de nuestras practicas tenemos que entra al laboratorio de química con nuestro equipo de bioseguridad completo y limpio. Una vez que tuvimos el portaobjetos con el Frotis y realizado ya todo el proceso de tinción de Gram se le aplico una gota de aceite de inmersión para poder observar el objetivo de 100x. En este proceso se podrá observar las bacterias de las colonias contaminadas, le agregamos el aceite de inmersión para que se pudiera ver con mayor facilidad, las bacterias que miramos son la de cocos y bacilos que ya con anterioridad investigamos las cuales son: cocos un tipo morfológico de bacteria. Tiene forma más o menos esférica (ninguna de sus dimensiones predomina claramente sobre las otras). Y los bacilos las bacterias con forma de bastón al observarse microscópicamente. Encontraremos una gran variedad de ellos de forma estructural diferente ya sea en forma de bastón, de espiral o esféricas.



observacion microscopica de un frotis


PRUEBA DE AGLUTINACIÓN EN SUERO SANGUÍNEO

Se llevo acabo en el laboratorio de la siguiente forma primero se usa la técnica de de venopunción de sangre fresca en volumen de 5.2 ml ya obtenida la sangre se deposita en el tubo con tapón rojo se espera unos 3 máximo 5 minutos en que coagulación ya cuando se tiene la sangre coagulada se retira el tapón rojo al tubo y se deposita en la centrifuga (auto clave) a 1500 revoluciones por minuto en 15 minutos verificando ya pasado los 15min se retira con cuidado para no revolver de nuevo la sangre con la sangre ya observando como se separo el suero de la sangre se toman un tobo de ensaye de cristal y con cuidado se deposita una porción de suero sanguíneo ya obtenida se toma la pipeta Pasteur y se deposita en la laminilla de cristal escarbada se puntea una sola gota de suero sanguíneo se ponen 6 gotas de suero ya puestas en el orden que deben ir se les aplican una gota de reactivo febriclin teniendo cuidado por que solamente se le debe depositar una sola gota en los céreo tipos “O H A B Brucella y Proteus” ya obtenido el orden de los céreo tipos se toman barios pedacitos de palillos se empiezan a mezclar cada gota de suero con la gota de reactivo pero con diferente palillo no puede ser el mismo para todos céreo tipos ya mezcladas se toma la laminilla y se empieza a mover de una forma de rotación durante un rato menos de 20 segundos ya tenemos la mezcla ya echa se mira microscópicamente y miramos unas cuantas cosas puntiagudas es que la prueba fue positiva.


aglutinacion en suero sanguineo


AGLUTINACION EN SANGRE.

En ella se Ocupara la técnica de venopunción para poder realizarse esta practica, Se ocupara Jeringa desechable y torniquete, torundas de algodón alcoholizadas y un tubo de ensaye rojo para depositar el paquete sanguíneo.
Se Ocupara 8 ml de sangre para realizar esta practica, Se empieza tentando la vena con la yema de los dedos y con la torundas alcoholizadas se utiliza la técnica de asepsia para limpiar la zona y así proseguir con ello, ya limpiada la zona y localizada la vena se introduce el punzo cortante de la jeringa en forma inclinada para no lastimar la vena del paciente, ya introducida la jeringa se siente cuando la aguja atraviesa la vena, ya introducida se saca el paquete sanguíneo jalando lentamente el válvula para obtener los 8 ml de paquete sanguíneo, ya obtenido el paquete sanguíneo se pone la torunda alcoholizada para poder sacar la aguja de la vena. Ya sacado el paquete sanguíneo se introduce en el tubo de ensaye de tapón rojo, y el paquete sanguíneo se baja automáticamente.
1- Ya sacado las muestras de sangre se toma con la pipeta Pasteur una gota de sangre fresca
2- se puntea una gota de sangre en al laminilla de escavada de porcelana
3- posteriormente s le aplica una gota de reactivo a cada una de las gotas de sangre fresca
Reactivos:
-anti-a (azul)
-anti-b (amarillo)
-anti-d (Rh)
4- Ya agregado las gotas de reactivo se observa la aglutinación de la sangre y se da como resultado el tipo sanguíneo

aglutinacion en sangre






Se hace el formulario y se reporta lo observado, con detalles de cada paso en cada práctica, se hacen las últimas anotaciones, conclusión del objetivo y planteamiento del problema. Se hace referencia a dudas.


GLOSARIO

SANGRE: es un tejido fluido que tiene un color rojo característico, debido a la presencia del pigmento hemoglobínico contenido en los eritrocitos.

CENTRIGUA: es una máquina que pone en rotación una muestra para separar por fuerza centrífuga sus componentes o fases (generalmente una sólida y una líquida), en función de su densidad.

AUTOCLAVE: es un dispositivo que sirve para esterilizar material de laboratorio, utilizando vapor de agua a alta presión y temperatura para ello, evitando con las altas presiones que el agua llegue a ebullir a pesar de su alta temperatura.

PLASMA sanguíneo: es la fracción líquida y a celular de la sangre.

MICROSCOPIO: es un microscopio basado en lentes ópticas. También se le conoce como microscopio de luz, microscopio fotófilo (que utiliza luz o "fotones") o microscopio de campo claro.

FROTIS: es un proceso científico que consiste en el extendido de una gota de sangre en la superficie de un portaobjetos o de un cubreobjetos, con el fin de analizarla posteriormente.

TINCION: es un tipo de tinción diferencial empleado en microbiología para la visualización de bacterias, sobre todo en muestras clínicas. Debe su nombre al bacteriólogo, Se utiliza tanto para poder referirse a la morfología celular bacteriana como para poder realizar una primera aproximación a la diferenciación bacteriana, considerándose Bacteria Gram positiva a las bacterias que se visualizan de color violeta y Bacteria Gram negativa.

ALGUTINACION: Agrupamiento en pequeños cúmulos de cuerpos formes (microbios, hematíes) portadores de un antígeno y en suspensión en un líquido originado cuando se introduce el anticuerpo correspondiente en el líquido.

SUERO SANGUINEO: es el componente de la sangre resultante tras permitir la coagulación de ésta y eliminar el coágulo de fibrina y otros componentes

ESTERILIZACION: es un proceso de apoyo a los procesos clave (los que actúan directamente sobre el paciente), fundamental en el correcto funcionamiento de un centro sanitario. Su importancia deriva de que se relaciona tanto con los valores éticos -proteger a los usuarios de infecciones oportunistas- como con los económicos, ya que minimiza los costes de no calidad.

MEDIO DE CULTIVO: El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo.

CONCLUSIÓN

Este trabajo fue de suma importancia para nuestro aprendizaje en el laboratorio de análisis clínicos, ya que hicimos las tres etapas la preanalitica, analítica y postanalitica, las cuales se llevaron a cabo en nueve practicas de la realización de medios de cultivo, la siembra, la observación microscópica, la elaboración del Frotis y sobre todo llevando a cabo la ven punción, ya que estas practicas son nuestros fundamentos dentro de la carrera de laboratoristas clínicos.

Las aglutinaciones en suero y en sangre también forman parte de los fundamentos de los laboratoristas, ya que en la segunda nos dimos cuenta del tipo sanguíneo de los dos pacientes y es muy satisfactorio para los estudiantes haber realizado estas prácticas y obtener más conocimiento de la materia; por nuestra parte es todo.


COMENTARIOS

· Las practicas van secuenciadas, por un error que se cometa al principio la practica se echa a perder totalmente, es por eso que se debe tener mucho cuidado al hacer la toma de cualquier material, ser muy exactos en la primera practica, al tomar la s medidas del medio que se ocupa, y no contaminar los medios, la técnica de venopuncion debe ser al momento de la practica para que la sangre sea fresca.

· Las prácticas estuvieron interesantes porque aprendes sobre los microorganismos con los que diariamente convivimos, igual que aprendemos sobre nuevas cosas que nos sirven no solo para la materia sino para la vida cotidiana.

· Las practicas realizadas en estas tres etapas de preanalitica, analítica y postanalitica fueron muy interesantes ya que adquirimos muchos conocimientos en este ciclo del semestre.


· Todas las practicas fueron divertidas y algo nuevo para nosotros en lo personal creo que si tenemos mucho que aprender por que en algunas practicas si se nos complico un poquito para realizar dicha practica, la practicas que mas me gustaron fueron las ultimas dos a mi parecer fueron las mas interesantes aunque no les entendí mucho al dar el tipo de sangre y eso pero pues de ahí en fuera todo lo de mas me pareció muy bien.

· Todas las practicas estuvieron muy divertidas pero ala vez estaban difíciles bueno no todas por que en la mayoría si estudie y si sabia como estar haciendo la practica pero fue algo nuevo para mi como también como mis compañeros del grupo pero eso es lo bueno de la practicas saber mas cosas de la especialidad pero todas las practicas me llamaron la atención aun que hubo uno que otro problema pero no tan grande como para reprobar pero si estuvieron todas la practicas muy bien echas y me siento orgulloso por mi mesa de que siempre le echamos ganas ala especialidad y mas por que nos gusta la especialidad y mas las practicas.


· Bueno todas las practicas estuvieron muy bonitas e interesantes, difíciles y fáciles pero aun así se pudieron hacer con la ayuda de nosotros y de nuestro conocimiento bueno hay va mi opinión pues opino que todo me gusto todo estuvo bien y la práctica más interesante fue la extracción de sangré ya que nosotros teníamos que extráela con todo y nervios pero lo malo es que yo no saque pero así aprendo viendo creo eso es todo de mi parte me gustaron todas la practicas estuvieron muy interesantes que tengas felices vacaciones.



BIBLIOGRAFIAS:

La práctica fue realizada por los mismos integrantes del equipo, pero estas son algunas páginas en las cuales encontramos información y algunas Tecnicas para la realización.

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Anexos

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